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黃曲霉毒素M1(Ⅰ型)ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃曲霉毒素是一類真菌(如黃曲霉和寄生曲霉)的有毒的代謝產(chǎn)物,它們具有很強(qiáng)的致癌性,主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些與人類血液,動物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的羥基化代謝產(chǎn)物,也是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)。牛乳及其制品是易受到黃曲霉毒素M1污染的食品之一。Aflatoxin M1的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC),薄層層析法(TLC)等。而使用黃曲霉毒素M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中黃曲霉毒素M1殘留。
【適用范圍】
可定性、定量檢測牛奶,奶粉等樣本中的黃曲霉毒素M1的含量。
【試驗原理】
本試劑盒采用競爭ELISA原理,在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素抗原,加入樣本/黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素M1與預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液,讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素M1的含量成負(fù)相關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素M1的含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度:0.1ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 30%
黃曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 5%
黃曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 7%
黃曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 100%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(2ml/瓶)
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 濃縮酶標(biāo)記物 1瓶 ………………………………… 1ml
4. 酶標(biāo)稀釋液1瓶 …………………………………… 7ml
5. 顯色液1瓶 ………………………………………… 12ml
6. 終止液1瓶 ………………………………………… 10ml
7. 濃縮洗滌液 (10×)1瓶 ……………………… 50ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備:
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅振蕩器
┅┅離心機(jī)
┅┅天平:感量0.01g
┅┅微量移液器:單道 20μl~200μl、200μl~1000μl,八道 300μl
試劑:
┅┅去離子水
【試劑配制】
1. 洗滌工作液:將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋(1份濃縮洗滌液+9份去離子水)。
2. 酶標(biāo)物的配制(現(xiàn)用現(xiàn)配,避光保存):將濃縮酶標(biāo)記物與酶標(biāo)稀釋液按1:19體積比進(jìn)行稀釋(1份酶濃縮液+19份酶標(biāo)稀釋液。
【樣本前處理步驟】
一、 牛奶(稀釋倍數(shù):1)
1. 取待測樣品,7000rpm室溫下離心,5min;
2. 取下層100μl待測。
二、 奶粉(稀釋倍數(shù):5)
1. 取1.0g奶粉,加入5ml去離子水,混勻;
2. 7000rpm室溫下離心,5min;
3. 取下層100μl待測。
【檢測步驟】
一、測定前須知:
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2~8℃。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。
4. 在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟:
1. 將所需試劑及微孔板取出,放置室溫(20~25℃)30min以上,液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封,放置于2~8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中,加入酶標(biāo)物50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30min。
6. 小心揭開蓋板膜,用洗滌工作液充分洗滌,300μl/孔,洗板5次,每次間隔30s,用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30min。
8. 加終止液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素M1實際含量。
【注意事項】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸,避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效期的試劑盒;也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6. 儲存條件:
試劑盒保存于2~8℃,不能冷凍,將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感,因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象:
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時,表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后,一般顯色時間為15~30min。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時間到35min(或更長),但不得超過40min。反之,則減短反應(yīng)時間。
9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【樣品最低檢測限】
牛奶………………………………………………0.1ppb
奶粉………………………………………………0.5ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個月。
電話:4006-099-690 郵編:100081 傳真:010-62158706 公司地址:北京市海淀區(qū)學(xué)院南路68號吉安大廈A座6層