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一. 石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象?
一般來(lái)說(shuō),如果用多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的片子做正常免疫組織化學(xué)染色的話是不會(huì)掉片子的。但如果要做抗原修復(fù)的話,如果片子處理不好的話是有可能掉片子的。你可以試試一下的方法:
1.一般用APES:丙酮=1:50的處理液來(lái)處理片子,處理5min左右,然后水洗,烘干既可用于貼片。如果把水滴再處理好的片子上,水比較聚的話說(shuō)明片子處理的好。
2.貼片子的時(shí)候,展片的時(shí)間要把握好,不要太長(zhǎng),否則不利于貼牢。
3.烤片子也很重要,切好的片子最好先不要馬上收起來(lái),而是水平至于烘片臺(tái)上37度兩個(gè)小時(shí)以上,一是水分徹底烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1個(gè)小時(shí)。
4.再補(bǔ)充一點(diǎn) ,石蠟包埋時(shí),酒精梯度脫水以及浸蠟等一點(diǎn)要充分,這對(duì)貼片也有影響。
如果這些導(dǎo)致掉片的因素都已經(jīng)排除但是片子還是掉的厲害,那么也可能是以下原因造成的:
1、多聚賴(lài)氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題。我原先是買(mǎi)的,邁新按說(shuō)也是不錯(cuò)的,可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子,要好一點(diǎn)。
2、組織切的不好,切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻,或者切片者手法不好等。
3、組織的問(wèn)題,我用的組織癌癥的很多,越是癌癥組織有壞死之類(lèi)越容易脫。
4、沒(méi)烤好,時(shí)間短溫度不夠之類(lèi)。
5、操作的時(shí)候甩的太猛了,有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩,用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
6、修復(fù)的問(wèn)題:抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了,或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好,咚的一聲就丟進(jìn)去了,這樣超容易脫片。此外,用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片,但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒(méi)辦法,只有從另外的問(wèn)題上著手。
此外,一旦見(jiàn)到有組織漂起來(lái)操作就更加要謹(jǐn)慎,用PBS的時(shí)候盡量用泡的,不要沖?;旧习堰@些方面都注意到了,能改善的盡量改善,脫片可以減少很多。
二. DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻:如一片著色,一片不著色或染色淺?
著色不均勻可能與你的實(shí)驗(yàn)手法有很大關(guān)系,可能原因有:
1.切出的片子厚度本身可能就不一樣,切出一片厚,一片薄,這樣可能造成著色深淺不一。
2.有可能是你 顯色液底物加到片子上后沒(méi)有搖勻,造成局部底物濃度不一致,所以加完顯色液后最好將片子來(lái)回左右晃動(dòng)幾下,使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。
3.如果你的片子是中間的染色深,靠近邊上的淺,那有可能是你蠟圈畫(huà)的太小,顯色液覆蓋的面積不過(guò)大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。
三. 切片染色后背景太深,不易區(qū)分特異性與非特異性著色?
a.也許是抗體本身有問(wèn)題,因?yàn)橛泻芏喙镜目贵w質(zhì)量并不好,很容易上背景,可以換一種抗體 試試。
b.如果經(jīng)費(fèi)不允許換抗體的話,你可降低抗體的濃度,并隨時(shí)注意觀察顯色,在能看到信號(hào)的情況下盡量降低背景。
c.可以換一種封閉液,不同的封閉液對(duì)某種來(lái)源的抗體來(lái)說(shuō),會(huì)有不同的封閉效果。
d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所檢測(cè)動(dòng)物組織的正常血清,這樣可以去除一部分非特異性染色。
全片著色
全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色,著色的強(qiáng)度可深可淺,總之,分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有:
(1)抗體濃度過(guò)高:一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是,每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試,使每一抗體個(gè)體化,找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度,既使是即用型的抗體也應(yīng)如此,不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。
(2)抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高:解決辦法是,嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘,及時(shí)提醒,避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)?,F(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí),而是30分鐘,因此,要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
(3)DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng):DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配,如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng),因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下,過(guò)氧化氫也會(huì) 游離出 氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控,達(dá)到 理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí),這樣做似乎不現(xiàn)實(shí),但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控,避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
(4)組織變干:修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì),采用DAKO筆或PAP Pen在組織周?chē)?huà)圈,可以有效的避免液體流失,也能提高操作速度。
(5)切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)(大于24小時(shí)):原因上不清楚,但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù),第二天加抗體進(jìn)行免疫組 化染 色,如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4?C冰箱過(guò)夜,對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響,如果放在室溫,特別是炎熱的夏天,會(huì)出現(xiàn)背景著色,因此,不可存放時(shí)間太 長(zhǎng)。
(6)一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體:注意抗體的有效期,過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買(mǎi)的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。
四. 免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果?
免疫組化出現(xiàn)陰性結(jié)果有可能組織本身就沒(méi)有信號(hào),也有可能是抗體出了問(wèn)題。可以找一些陽(yáng)性組織做一下,以確定是抗體的問(wèn)題還是組織本身就沒(méi)有所檢測(cè)的抗原表達(dá)。還有,可以提高抗體的濃度,或者試一試抗原修復(fù)等方法,也許會(huì)得到意想不到的結(jié)果。
五. 一抗從4度拿出后,為什么有人說(shuō)要37度復(fù)溫,目的是什么?
1. 一方面,防止切片從4度直接放入PBS易脫片;
2. 另一方面,使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
六. 免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么?尤其是微波修復(fù)。
關(guān)于抗原修復(fù),我個(gè)人的觀點(diǎn)和panther75有點(diǎn)不同。我試過(guò)的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù),檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 來(lái)看,微波修復(fù)其實(shí)很不容易掉片子的,而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因?yàn)榈羝又饕且驗(yàn)榧訜徇^(guò)程中產(chǎn)生的氣泡所引起,而微波修復(fù)水加 熱到沸騰,沾在片子上的氣泡就會(huì)少,不會(huì)因?yàn)樾馀萆洗鹈撈?。做EDTA修復(fù)時(shí),你可以將片子靠的盡量近些,或是在載玻片四周墊些棉花什么的,然后蓋 上蓋玻片,這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。
我們用的微波修復(fù)條件為:
2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水,調(diào)ph值至6.0,微波修復(fù)10分鐘。你可以試試,時(shí)間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。
七. 有人在一抗孵育前用tritonX100來(lái)通透細(xì)胞,對(duì)石蠟切片需要否?
用石蠟切片做免疫組化是不需要透膜處理的,一是因?yàn)槭炃衅容^薄,另外一個(gè)原因我認(rèn)為是在包埋過(guò)程中細(xì)胞膜已經(jīng)被破壞,所以這一步可以省略。
八. 蘇木素復(fù)染的時(shí)間應(yīng)該是多少?復(fù)染過(guò)度咋辦?
復(fù)染時(shí)間不需要太長(zhǎng),當(dāng)然這也要根據(jù)蘇木精的質(zhì)量來(lái)確定,但基本上不要超多一分鐘。染色過(guò)深的話可以用酸性的水溶液(在水里滴加少量濃鹽酸)分色,分色的另 外一個(gè)目的是洗掉蘇木精在細(xì)胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合,這樣可以使細(xì)胞質(zhì)中的特異信號(hào)更明顯。所以不管復(fù)染是不是過(guò)度,分色這一步最好不要省掉。分色后記得再 用氨水返藍(lán)一下。
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